模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成DNA脱嘌呤而影响PCR的结果。
dNTP浓渡过高。减少dNTP的浓度。
退火温度偏低，退火及延伸时间偏长。应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采取二种温度的PCR扩增。以2度为梯度设计梯度PCR反映优化退火温度。
（5）样品处理不当。
（6）Mg2+浓度偏高，因适量调整Mg2+使用浓度。
（7）若为PCR试剂盒，也可能时试剂盒自身质量有问题。
（8）复制提早终止。使用非热启动的聚合酶经常有产生。冰上筹备反映体系或采取热启动聚合酶。
（9）反映缓冲液未完整熔化或未充沛混匀。确保反映缓冲液熔化完整并彻底混匀。
（10）引物特异性差。应用BLAST检查引物特异性或从新设计引物。
（11）引物量过量。减少反映体系中引物的用量。
（12）模板量过量。质粒DNA的用量应<50ng，而基因组DNA则应<200ng。
（13）外源DNA污染。确保操作的洁净。
（1）试剂，枪头，工作台污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。
（1）污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。
（2）模板或引物使用毛病。查看引物是不是会扩增部份条带和模板是不是正确。
3)基因亚型。对研究的基因进行序列分析和BLAST研究。
（1）起始退火温度过低，或目的扩增产物和非目的产物的T值相差不大。可尝试适量提高PCR温度或者设置下降PCR，降低循环数。
（1）可从新以菌落和菌液为模板进行PCR对比检测，由于菌落PCR的假阳性几率还是比较高。如果仍出现上述结果，推测多是平板上连接液中的未连接载体的扩增引发的目的条带，进一步质粒PCR检测，可证明目的片断是不是真正连接胜利。
原文链接：https://mp.weixin.qq.com/s/44KIdO1UeRH5X5X4fpO1Wg
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